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水稻中一种新的蛋白酶抑制剂基因的扩增

http://y.sina.com.cn 2005年08月16日 14:42 北京大学附属中学

  作者:张 奕

  指导教师:陈章良 顾红雅 翟礼嘉

  (北京大学生命科学院)

  第九届全国青少年发明创造比赛和科学讨论会科学论文二等奖

  摘 要

  植物蛋白酶抑制剂在植物抵御病虫害中起着重要的作用,本实验通过对水稻蛋白酶抑制剂RBBl28基因进行PCR扩增,加上终止密码子以便在原核体系中进行表达,从而为进一步研究其蛋白产物的功能作好了准备。

  一、前言

  蛋白酶抑制剂广泛存在于各种生命体中,例如:在高等动物血液中,每lOOnd血清含有超过200mg的各种抑制剂。在植物中,大多数储存器官,如种子、块茎中,约1%—10%的总蛋白为各种形式的蛋白酶抑制剂。

  植物蛋白酶抑制剂在植物抑御病虫害中起着重要的作用。自1987年Hilde等人首次将豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转入烟草并证明转基因植物有明显的抗虫效果以来,人们一直怀着极大的兴趣努力寻找抗虫作用强、适合于在重要粮食经济作物中表达的蛋白酶抑制剂基因。 本实验室在研究中得到一种具有抑制蛋白酶活性的功能性蛋白,通过对其部分氨基酸测序,并参照其序列和水稻偏爱密码子设计引物,应用PCR扩增并克隆得到一种水稻蛋白酶抑制剂基因RBBI28。为将其表达,采用PCR的方法在3’端加上终止密码子TAA,先克隆到质粒pBlusecript SK中,再克隆到表达载体pET28a中进行表达。

  二、实验材料

  (1)受体菌E.coliDH5a,克隆载体pBlusecriptSK。

  (2)限制性内切酶,T4DNA连接酶,X—gal,IPIG,DNA分子量标记。(为Promega产品)

  (3)其余试剂均为国产分析纯试剂。

  (4)常用试剂:

  ①溶液I:

  50mmol/L葡萄糖

  25rmnol/L Tris-HCI(PH8.0)

  lOmmol/L EDTA(PH8.0)

  ②溶液Ⅱ:

  0.2mol/L NaOH

  1% SDS

  ③溶液Ⅲ:

  5mol/L KAc 60ml

  冰醋酸 11.5ml

  蒸馏水 28.5ml

  ④TE缓冲液:

  10mmol/L Tris-HCl(PH8.0)

  tmmol/L EDTA(PH8.0)

  ⑤Ids-醋酸缓冲液(TAE),可配成10X的贮存液

  ⑥LB培养基:

  细菌用胰化胨 10g

  细菌用浓缩酵母浸出粉 5g

  Nacl 5g

  固体培养基则加入1.5%的琼脂。

  三、实验方法

  (一)目的基因的扩增

  由于得到的水稻胰蛋白酶抑制剂基因RBBI28无终止密码子,所以采用PCR的方法在3’端加上终止密码子TAA以用于表达。

  1.PCR原理

  通过酶促反应在体外成百万倍地扩增一段目的基因,它是基于位于待扩增目的基因两端互补的两个引物与该目的基因序列退火而后延伸最终达到扩增目的的。

  2.PCR过程

  (1)设计引物:两条引物分别与待扩增目的基因一端的一条链序列互补。我在实验中两次使用的引物分别是:

  第一次:

  5’引物:5’GTAATACGACTCACTATAGGGC3’

  3’引物:5’GGAATTCTTATCTFGGCTTGCAGACGGG

  CCCTGGC3’

  第二次

  5’引物:5’CCATATGGAGAGGCCATGGAAG3’

  3’引物:5’CAAGCTYATCGGCA3TITGCACATGGG3’

  (2)变性:DNA双链变性解成单链,温度为94-98°C

  (3)退火:每个引物通过退火“粘”到一条链上,温度为37——65°C。

  (4)延伸:PCR体系在DNA聚合酶的作用下,以体系中的dNTP为底物,在引物各模板的复合体上,从5’到3’开始复制目的片段,温度为72°C

  3.双链DNA模板的PCR扩增

  在一个灭菌的标准0.5ml的新Eppendorf管中加入,Taq缓冲液(10X)5μL,dNTP5μL,3’引物,5’引物各2.5μL(10pmol/ml),模板DNA(1—10ng),加水补至49mI,将以上溶液混匀,加入1μLTaq酶(3U),混匀后盖上一层矿物油(约50μL)。按变性94°C,lmin;复性48°C,lmin;延伸72°C,lmin;做PCR循环,循环35次。循环结束后,在72°C保温10min,保证扩增出来的目的片段都是全长,吸去矿物油。取5μL体积的反应液走1.2%的琼脂糖电泳以分开目的基因。

  4.PCR产物的回收及纯化

  (1)电泳:PCR产物加1/5体积的上样缓冲液,用1.2%琼脂(含0.5μg/mlEB),电泳恒流10mA,走至胶板中部时,用紫外灯确定所需条带的位置,用刀片切下含有目的条带的琼脂糖。

  (2)透析回收:将处理好的透析管用蒸馏水和TE清洗,

  用透析管夹将一端封住加入lm TE,将琼脂糖切块转移至透析管中,靠紧一侧,除去气泡,将透析管夹紧。置于盛有新的1 TAE的电泳槽中,恒流40mA约30min,用紫外灯观察,至片段集中于透析管另一侧,反向电泳40sec,将TE吸至一Eppendorf管中,用酚:氯仿(1:1),氯仿抽提,最后用无水乙醇沉淀,-20℃放置30min,4℃,12000r/min离心10min,再用70%乙醇洗涤沉淀,真空抽干后溶于20μLTE中。

  (二)重组体DNA的构建

  1.质粒的制备(碱法小量置备)平板上挑取单菌落于5ml含氨苄青霉素(50mg/L)的LB培养基中,37°C振荡过夜。用1.5ml Eppendoff管于4°C,12000r/min离心1min。 将菌离心下来,弃上清。加入200μL溶液II,剧烈振荡混匀,于室温放置5min。加200μL新配制的溶液II,盖紧,迅速颠倒2—3次以混匀,于冰上放置5min,然后加入150μL用冰预冷的溶液III,轻轻摇匀,冰上放置5min,4℃,12000r/min离心5min,将下清转移到另一Eppendorf管中,加入等体积的酚:氯仿(1:1)剧烈振荡,4℃,12000r/min离心5min,将水相将卜清转移到另一Eppendorf管中。同样再用氯仿抽提一次,在水相加 2.5体积的无水乙醇和0.05体积5mol/L。的NaCl,于-20℃放置30min,然后4℃,12000r/min离心10min,弃上清,再用70%的

  乙醇洗涤沉淀,真空抽干后溶于20μLTE中。

  2。质粒的酶切鉴定

  在20μL体系中,加入约0.1μg的质粒,0.5μL的内切酶,2μL相应的缓冲液,37℃保温2h加1/5体积上样缓冲液,走琼脂糖电泳鉴定。

  3.PCR产物与T-vector的连接

  在10μL体系中,加入lμL连接缓冲液,1μL T4DNA连接酶,lμL pBS-Tvector,2μL回收的PCB产物,用蒸馏水补足体积,冰上放置24h。

  4.大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

  (1)感受态细胞的制备:从新活化的E·coliDH5a菌平板上挑取一单菌落,接种于3mlLB液体培养基中,37℃振荡培养12h左右,至对数生长期,1:100接种于100mlLB液体培养基中,37℃振荡培养2.5-3h左右,将培养液在冰上冷却片刻后,转入无菌的离心管,于4℃,4000r/min离心10rain,弃上清,用4ml冰冷的0.1moL/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置片刻后即制成了感受态细胞。制备好的感受态细胞可在冰上放置,24h内用于转化实验,或加入30%体积的甘油后,分装于Eppendoff管中(200μL/管),于-70℃保存。

  (2)感受态细胞的转化:取感受态细胞,于冰上放置5mm

  化开,加入10μL连接产物,轻轻摇匀,冰卜放置40min后,于42~C水浴中热激2min,冰上放置5min后,加入150μLLB(不含Amp)37~C保温1h,取100μL加20mlX—al和20μL IPGT,涂于含有Amp(50μg/ml)的舰平板培养基上,倒置平板,37~C培养12 -16h。挑取白斑进行鉴定。

  四、结果与讨论

  第一次做完PCR,将产物与T-vector连接后做测序,但是结果显示,没有加上终止密码子‘TAA’,仍为原来的pBSRBBI28,可能由于引物合成的时间较长,有部分降解。

  第二次重新合成引物,做PCR,得到清晰的约280bp左右的条带。使用第二对引物,筛选得到了三个克隆,pBS-RBBI28 1,2,3。

  PCR反应的几个要点:

  (1)引物:引物的长度一般以18—28个核苷酸为宜,而且G/C的含量约占50%~60%。引物的3’端应尽量避免互补结构,否则极有可能形成引物二聚体而降低目的产物的扩增量。

  (2)温度:退火温度很重要,它与PCR扩增的特异性有很大关系。提高退火温度有助于消除“错误退火”,减少3’端引物的错误延伸,提高PCR产物的特异性。


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